光緒三十四年十月二十一日（1908年11月14日）傍晚5點左右，光緒在中南海瀛臺涵元殿含恨病死，年僅38歲。光緒死時身邊無一人，人們發現時，光緒屍體早已變冷發硬。更詭異的是，第二天下午慈禧太后病死於中南海儀鸞殿，終年74歲。
大清國兩個最高統治者，去世時間相差隔不到24小時，著實讓人震驚。慈禧太后是病死的，這點已經沒有疑問，可光緒正值壯年，他是怎麼死的？直到百年後，專家們終於得知了光緒的死因。
2008年11月，《清光緒帝死因研究工作報告》正式對外發布，在長達萬字的報告中，專家們最終確定了光緒的死因：死於砒霜中毒死亡。專家們在光緒的遺骨、頭髮、衣物中，都發現了高含量的砷化物，鑑定為劇毒的三氧化二砷，即砒霜。
中毒而亡是板上釘釘，那麼誰是凶手？種種跡象表明，凶手指向了晚清實際統治者，慈禧太后。晚清御史、光緒的近臣惲毓鼎在《崇陵傳信錄》中記載了這樣一件事：說是光緒去世前夕得知太后也病重，臉上表露喜色，慈禧對近臣說，“我不能先而死！”於是，慈禧太后決定自己死前，神不知鬼不覺地殺掉光緒，這就是“慈禧毒死說”。
啟功先生在《啟功口述歷史》中記載，他的曾祖父（浦良）曾在慈禧太后住處樂壽堂外侍疾，“西太后死前，我曾祖父看見一個太監端著一個蓋碗從樂壽堂裡走出來。”出於自身的職責，浦良就問太監端著的是什麼？
太監回答道：“這是老佛爺賞賜給萬歲爺的塌喇（即酸奶）。”光緒死前，雖然身體狀況一般，但一直沒有患重病。可從太監送了塌喇後不久，慈禧太后就著人宣佈皇帝駕崩。
清朝滅亡後，滿清遺老爭相爆料，他們在各種回憶錄、日記等談論光緒之死，並給出自己的判斷。因此，慈禧太后是光緒之死的最大嫌疑人，尤其是戊戌變法期間發生了宮廷政變“圍園弒後”。這一密謀事件雖然是康有為一手策劃的，光緒毫不知情，但是慈禧太后明顯把這筆賬算在了光緒頭上。
慈禧太后
最後插一句，溥儀在《我的前半生》中談到，凶手是袁世凱。溥儀認為，袁世凱在戊戌變法的關鍵時刻辜負了光緒的信任，他擔任慈禧太后一死，光緒找自己算賬，於是趁著進藥之際，毒殺光緒。這種說法基本上沒有一點可信度，總之，關於光緒之死的爭議還將一直持續下去。